【分享】細菌分類的濫觴和演變

[wandey 10]

形態學時代

細菌是微生物學中的要角，有關其分類的探討可以從各種角度切入，但是最早期的細菌分類，純以形態特徵的區分為主。細菌分類經歷形態學、生理學及生化學、化學分類學、分子生物學等階段，目前已進展到一個嶄新的里程。

細菌不同於動植物，無法直接利用肉眼觀察其形態，因此研究方法有其獨特之處。研究細菌，首先須在無菌條件下操作，進行純化分離，藉此取得純菌株。除了無菌操作外，確立細菌純化分離方法的關鍵因素，包括培養皿的研製、利用洋菜配製培養基、滅菌釜的發明等。

1882 年，赫斯（W. Hesse）發現從紅藻萃取出來的多醣類物質，也就是俗稱的洋菜，適合做為培養基固化劑。他把這項發現告知柯霍（R. Koch）以後，不只促成柯霍分離出結核菌，也帶動此後微生物學研究的迅速發展。1887 年，貝特力（R.J. Petri）研發啟用培養皿，使得處理微生物不再是難事。

1884 年，革蘭（C. Gram）發明了革蘭氏染色法，進行組織內細菌分染。1890 年，羅福樂（F. Lffler）研創細菌鞭毛染色法，藉此完成了一些細菌鞭毛著生狀態的報告。革蘭和羅福樂的報告顯示，19 世紀晚期的攝影技術已經相當進步。細菌細胞的觀察辨認，也因顯微鏡的改良進步和染色法的開發應用而成為可能。類似上述觀察、培養和分離細菌的方法，也廣泛應用於研究其他的微生物。

德國植物學者柯恩（F. Cohn）原本從事植物生理，以及藻類和低等菌類的分類與形態研究，後來著手研究細菌。1872 年，他把細菌分為球菌、短桿菌、長桿菌和螺旋菌4群，並且記載了微球菌、細菌、桿菌、弧菌、螺旋菌、螺旋體等六屬。當時，柯恩把細菌定義為：

具有特定形態，不具葉綠體的細胞；利用分裂方式繁殖，以單細胞、絲狀細胞或集合體的方式生長。

在細菌分類系統不明確的年代，柯恩根據自身觀察並詳查當時文獻後指出，細菌的屬種與動植物的屬種不同，是以形態異同為依歸的形態屬、形態種。他認為日後釐清細菌細胞的形態和其他形質的關係以後，細菌屬種的概念才可望明確。他也察覺一般細菌和藍細菌類似之處，這對後來原核生物和真核生物的分類有指引的作用。

柯恩把細菌分為四群，並非只是把相同形態的集合在一起而已，而是根據廣泛研究與比對後歸納出來的結論。他認為以形態為基礎整理出的屬種與細菌的代謝、色素生成、病原性等的關聯，須待日後更多的研究才能釐清。值得一提的是，柯恩是枯草桿菌的命名者，他指出這種桿菌可產生孢子，孢子萌發後成為活細胞。他證實枯草桿菌的孢子具耐熱性，這是支持巴斯德（L. Pasteur）所提倡非自然發生說的有利證據。

柯霍從死於炭疽病的動物分離出細菌，將其培養且接種至健康動物後，發現可使健康動物感染炭疽病，而且可從遭受感染的動物體內分離出原來接種的細菌。所謂柯霍準則（Koch's postulates），亦即驗證細菌是病因的一系列步驟，乃由此而來。

柯恩相當肯定柯霍的炭疽病研究，他除了協助柯霍把病原菌命名為炭疽桿菌外，還發現炭疽桿菌與枯草桿菌具類似的形態，都會產生孢子，但是兩者當中只有炭疽桿菌是病原菌。因為有上述種種研究成果，杜錄思（G. Drews）在 1999 年撰文推崇柯恩是現代微生物學的始祖。

生理學與生化學時代

細菌形態簡單，不易藉之區分不同菌種，因此早在 19 世紀晚期，生理和生化性質已開始被採用為細菌分類的指標。

1889 年，貝傑林克（M.W. Beijerinck）以磷光素生成為基礎，設立發光細菌屬，這是最早把生化性質導入細菌分類的實例。他利用選擇培養基進行增菌培養，分離出定氮桿菌屬細菌，以及多種光合微生物和化合微生物。他也利用醣類發酵和硝酸還原進行當時名為產氣桿菌屬，如今已改名為腸內桿菌屬細菌的鑑定。1892 年，維諾格拉斯基（S. Winogradsky）以自營能力為指標，設立了亞硝酸單胞菌屬及亞硝酸桿菌屬。

麥古拉（M. Migula）是柯恩的研究伙伴，他於 1900 年發表《細菌系統》一書，其中記載約 1,300 種細菌，並提及明膠液化。麥古拉在該書中依照細胞內含硫粒和光合色素，把細菌分為真細菌及硫細菌。

1909 年，歐拉詹森（S. Orla-Jensen）調查細菌鞭毛著生位置和代謝，藉此把細菌分為頭端鞭毛類和周鞭毛類兩亞目。頭端鞭毛類包含球狀、桿狀和螺旋狀細菌，其中有運動能力的具有極鞭毛。周鞭毛類也包含球狀和桿狀細菌，但不含螺旋狀細菌，其中有運動能力的具有周鞭毛。

克魯維爾（A.J. Kluyver）是貝傑林克的接班人，他的研究主題是「微生物是什麼樣的生物？」，並以一般的微生物學觀點，廣泛進行研究。1924 年，克魯維爾發表了〈微生物代謝的統整與分歧〉一文，他也曾根據酵母的醣類發酵特性，進行醣類區分及定量。1933 年，他和帕坤（L.H.C. Perquin）共同發表了黴菌震盪培養，其實驗所用的克魯維爾三角瓶是通氣培養器材的始祖。

1936 年，克魯維爾和范尼爾（C.B. van Niel）根據細胞形態、運動性和營養方式，做了「細菌屬」的分類。這是一個類似元素周期表的組合，推測日後會發現的屬，則空欄以待。他們論及細菌演化，認為球菌是最簡單的細菌，由此演化出其他類別的細菌。這種觀點並不正確，但是他們標榜以一般微生物學觀點，嘗試把細菌分類與形態學和生化學結合一起的努力，仍然值得肯定。

1957 年，英國學者史尼斯（P.H.A. Sneath）把 18 世紀亞當森（M. Adanson）提倡的生物分類原理具體化，倡導數值分類學。亞當森對當時主流觀點，即林奈（C. von Linn^重視特定形質的觀點，抱持懷疑的看法。他主張應把所有形質視為等價（同等重要）。不過，數值分類開始風行是電腦發達以後的事情了。

數值分類表示相似度，有納入或不納入負的相符二類算式，前者是單純相符，後者如傑卡德式。二類算式都有人使用，其計算方法各有多種。

曾經盛極一時的數值分類，不再風行的理由如下。一、史尼斯指出用於數值分類的形質，須是利用相同方法取得的數據資料。然而不少研究實例，都是蒐集自不同文獻，利用不同方法獲得的數據資料來計算。二、如依據抗生素感受性之類的特定形質進行計算，悖離數值分類原理。三、依照數值分類建構的樹狀圖，大多無法以其他方法驗證其妥適性。

例如曾經有人根據 119 種性狀資料建構短桿菌群的數值分類樹狀圖，發現與利用化學分類（DNA 鹼基組成，DNA／DNA 相關性等）為依據所得到的分析結果，二者完全不具任何相關性。經改為只取用其中 57 種研判適用於數值分類的形質，重行分析建構的樹狀圖，則與化學分類的分析結果具有高度相關性。

細菌分類今後勢必愈來愈倚重電腦，但這與電腦用於傳統的細菌數值分類，不能混為一談。正如光學顯微鏡的發達對細菌分類帶來巨大影響，電子顯微鏡的發明及超薄切片技術的開發，使得吾人得以觀察細菌細胞的基本構造。位相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡、掃描式電子顯微鏡等的發明，也讓生物細胞變得更容易觀察，藉此可辨識原核和真核生物細胞的基本構造，並區分細菌和其他微生物的差別。

1957 年，道夫提（E.C. Dougherty）經由鏡檢察覺，細菌細胞核比其他生物細胞核簡單，因而提議把細菌的細胞核稱為原核，其他生物的細胞核則稱為真核。

1962 年，史丹尼（R.Y. Stanier）和范尼爾共同發表的〈細菌概念〉，可說是有關微生物多樣性研究的集大成論文。該文指出細菌細胞是原核細胞，具有如下特徵：一、不具區隔細胞核和細胞質的細胞核膜；二、不具含有光合作用或呼吸作用相關酵素的機械構造；三、細胞核分裂屬於無絲分裂而非有絲分裂。史丹尼和范尼爾兩人以細胞構造相同性，印證了柯恩所推測細菌和藍細菌的近緣關係。

化學分類學時代

化學分類著重於研究 DNA、RNA、蛋白質等物質，以及其他維持生命所需細胞成分，藉此探討微生物的分類、鑑定和演化。最早的化學分類學研究，是藉由色素和精油的化學構造探討植物的類緣關係。1962 年，馬莫（J. Marmur）和杜提（P. Doty）把 DNA 鹼基組成導入細菌分類學的研究。後來 DNA／DNA 相關性、脂肪酸組成、磷脂質組成、醌型、酵素蛋白質電泳圖譜等，也陸續被採用為細菌分類的依據。

以下事例反映了化學分類學的發展：一、以探討 DNA、RNA、蛋白質和其他細胞成分為基礎的生化、分生和遺傳的發展進步，開啟了建立微生物的系統和相互關係的門路；二、儀器的開發進步，使得眾多樣品所含微量成分的分析得以在短時間內完成；三、電腦功能不斷強化，因而得以利用數理統計處理眾多數據；四、微生物保存方法的研發充實，使得原本不易保存的微生物，不再難以保存；五、菌株保存機構的增加和國際化，使得標準株和參考株不再難以取得。

早期學者常有想把自己分離的菌株與其他已發表的菌株作比較，卻苦於無從取得的情形。也有根據記載資料比較，認為明顯不同，俟取得菌株實際檢核比對後，卻發現並無兩樣。因此，菌株收集的充實對細菌分類學的研究有相當大的助益。

化學分類最重要成果之一，在於根據 DNA／DNA 相關性定義的「細菌種」概念，廣為細菌分類學者支持。1987 年，原名「國際系統細菌學委員會（International Committee on Systematic Bacteriology，簡稱 ICSB）」的「國際原核生物分類系統委員會」（International Committee on Systematics of Prokaryotes，簡稱 ICSP）轄下某一特別部會，對於「細菌種」發表過類似見解：

一種細菌的親緣定義，在於所含菌株彼此間具 70％ 或更高的 DNA／DNA 相關性，同時也具有攝氏五度或更低的 ΔTm 值。

把含有 DNA 的薄鹽溶液緩慢加熱至一定溫度以上時，該溶液在紫外光波長區的吸光值會開始不斷增大，繼續升溫至一定溫度後，吸光值就達恆定不再改變。吸光值增大是因 DNA 雙股螺旋構造受熱融解，變成單股 DNA 之故。吸光值增大的溫度區間之點溫度稱為 DNA 的熱變性溫度或融點 Tm ，ΔTm 意指兩菌株間的 Tm 差距。惟 ICSP 並未正式認可這一見解。

根據這一見解，不少以前被鑑定為同種的細菌株，陸續被指出其實並非同種。顯然，早期菌種中心收集的保存株，難免包含一些鑑定錯誤的。因此，種內菌株關係研究不夠充分的菌種，今後有必要以 DNA／DNA 相關性為依據進行檢討。

分子分類學時代

1965 年，查克勘得（E. Zuckerkandl）和保淩（L. Pauling）在其合著〈演化歷史的分子紀錄〉一文中，提出「資訊大分子」是生物演化的分子時鐘概念，由此開啟了分子分類學的序幕。資訊大分子是指負載遺傳訊息，或其轉譯訊息的大分子化合物，包括 DNA、RNA 和蛋白質。他們認為最合理、最普遍的演化系統，應完全根據資訊大分子提供的訊息來重建。

1968 年，日本學者木村（M. Kimura）以群聚遺傳學為依據，發表了「分子演化的中立理論」，藉由導入核酸置換率（Knuc），標示生物演化距離。這一學說使得沒有化石紀錄的微生物演化，成為可以探討論述的課題。

1987年，伍斯（C.R .Woese）的研究團隊利用 16S rRNA 目錄法，進行細菌演化系統的研究，由此建構出微生物的分子系統學。更早之前的 1979 年，堀（H. Hori）和小澤（S. Osawa）兩位日本學者，根據 5S rRNA 序列重建生物系統樹（包括細菌和人在內的形形色色生物），他們認為伍斯所指古細菌比真細菌出現晚，而且比真細菌接近真核生物，因此稱為後生細菌。

這一見解後來受到伍斯的認同，因此古細菌被改稱為古生物。伍斯研究團隊原本使用 SAB（不同菌株 16S rRNA 序列相似度）表示演化距離，後來改用木村所用的 Knuc。

微生物系統關係透過上述先驅性研究，愈來愈清楚。分子分類學發展給生物分類學帶來的最大影響，在於確認以往被認為處於生物最高階層的動物界、植物界和細菌三者之間，動植物比較相近，兩者都與細菌相距甚遠，因而有比「界」更高階的「域」的提議。原被稱為古細菌的原核生物，在演化路徑上其實與真細菌迥異，因此改稱古生物，自成一域。有關細菌系統的研究，已經有很多相關報告。

其中普羅提歐門細菌約略等同於革蘭氏陰性細菌，包括 α、β、γ、δ 和 ε 五群。

1968 年在東京舉行的第一屆世界微生物株保存會議中，柯威兒（R.R. Colwell）以海洋弧菌為例，提倡多元分類，也就是多方探討，把可能取得的實驗數據全部用於分類學研究。目前多元分類或多元探討，已經成為微生物分類學的廣泛用語。

其實早在 1970 年代，已經出現不少利用多元手法探討細菌分類的相關文獻，只是當時尚未使用多元分類之類的語彙而已。例如 1972 年，山形（K. Yamagata） 和駒形（K. Komagata）兩位日本學者曾根據細胞分裂模式、DNA 鹼基組成、細胞壁組成等研究數據，探討了棒狀桿菌中被歸類於不同屬群菌株的相互關係。

細菌分類學要素

柯宛（S.T. Cowan）是英國著名的細菌分類學者，他在 1965 年撰文指出，細菌分類包括分類（製作細菌分類體系，把各個細菌分類群擺置於能反映系統的階層）、鑑定（辨認分離株特徵，對照分類體系，決定分離株的分類位置）和命名（對分類群加以命名）三項要素。這三項要素其實有如雞尾酒般混合在一起，不易明確區分。1993 年，駒形綜觀細菌學發展，進一步提出細菌分類學除了分類、命名和鑑定外，應再加上系統（細菌的系統演化）的見解。

細菌學研究初期，分類體系尚未建立，細菌命名不具統整性。隨著研究逐漸進展，系統研究和鑑定實務兩條路線開始出現觀念落差。細菌分類基本上具有哲學和實務兩個面相，前者是分類和系統的研究，後者則是鑑定實務，兩者似有矛盾，其實是構成細菌分類的共同要素。細菌分類的健全茁壯，有賴分類、命名、鑑定和系統四個構成要素的均衡發展。

伯吉氏系統細菌學手冊

《伯吉氏系統細菌學手冊》（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology，簡稱 BMSB）是從事細菌分類鑑定不可或缺的檢索書，惟不少微生物學者並未充分了解這本書的性質，因此特別把它的由來簡單說明如下。

1915 年，美國細菌學家學會（已改名為美國微生物學會）總會為了做成科或屬層次的細菌分類綱要，通過成立以溫斯露（C.E.A. Winslow）為委員長的細菌特性分析及分類委員會。因為 1900 年以來，出現了溫斯露、周普（W. Zopf）、麥古拉、古陸斯（W. Kruse）、詹森（C.O. Jensen）等人建立的多套細菌分類系統，不知其中哪一套最適用。該會綜合檢討後，在 1917 年先發表了細菌分類建議綱要，繼而於 1920 年提出只及於科或屬層次分類的最終報告。

美國細菌學家學會為了進一步出版可以檢索至種的檢索書，於是成立了以伯吉（D.H. Bergey）為委員長的委員會。經過廣泛文獻調查，《伯吉氏鑑定細菌學手冊》（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology，簡稱 BMDB）初版在 1923 年問世，其中包含 13 科 94 屬。後來 2 ~ 8 版陸續於 1925、1930、1934、1939、1948、1957、1974 等年度出版，因會計問題，四版以後改由伯吉氏手冊信託（Bergey's Manual Trust）發行。

有鑒於細菌分類的蓬勃發展，伯吉氏手冊信託大幅更新內容，於 1984 年出版《伯吉氏系統細菌學手冊》第一卷。接著 1986 年出版第二卷，1989 年出版第三、四卷。

第一卷收錄了在基礎、醫學、工業等範疇占有重要地位的革蘭氏陰性細菌。第二卷收錄放線菌以外的革蘭氏陽性細菌。第三卷包含藍細菌和其他光合細菌、第一卷未收錄的革蘭氏陰性細菌、以及當時稱為古細菌如今已正名為古生物的微生物。第四卷收錄放線菌。1994 年，伯吉氏信託繼續出版以檢索為主的 BMDB 第九版，其中包含一些後來增加的新屬。

BMSB 第二版的第一、二卷已陸續於 2001 年與 2005 年出版，第一卷收錄古生物（甲烷生成者、高度好熱者、高度好鹽者等）、藍細菌等光合細菌，以及一些具特異性、大多棲息於極端環境中的細菌。第二卷收錄包含絕大多數種類革蘭氏陰性細菌的普羅提歐門細菌。

第二版 BMSB 內含許多細菌分類學相關用語，極具參考價值。因尚未全部出版，無法窺得全貌，惟知其與第一版不同處，在於以 16S rRNA 基因序列比對為基礎建構系統，做成分類層級，並把原核生物分為古生物域和細菌域，兩域分別包含二門和 23 門。

BMSB 廣為細菌分類學者和實務者使用，加上其執筆者有許多是 ICSP 所轄不同專門委員會的委員，因此這本書當然有它的權威性。然而必須認清的是，BMSB 並非公定書，因其發行者是伯吉手冊信託，而非 ICSP。ICSP 是國際上細菌分類、命名的公定機構，《國際系統演化微生物學期刊》（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，簡稱 IJSEM；原名 International Journal of Systematic Bacteriology，簡稱 IJSB）是這機構發行的唯一期刊，有關細菌分類和命名，悉以 IJSEM 所載為準。

今後的細菌分類學

細菌分類學逐步發展，目前已走到包含形態、生理、生化、細胞、生態、遺傳、分子生物等多元範疇分類的時代，這種發展態勢今後應不致改變。

最近隨機增幅多型 DNA（randomly amplified polymorphic DNA，簡稱 RAPD）與增幅片段長度多型性（amplified fragment length polymorphism，簡稱 AFLP）分析法，以及其他基因體資訊解析法，被用於細菌分型、分類和演化的研究，也有報告論及這些方法所含問題。

以細菌分類學立場來看，這類方法的適用性，除了理論根據之外，尚須透過很多數據資料加以比對驗證。這些方法適合於什麼目的？適用於哪些分類層級？是否只適用於特定類別細菌？這些問題有待逐一加以探討。隨著微生物多樣性的研究日趨發展，新種微生物不斷被分離發表，今後微生物所含新機能勢必不斷地被發掘出來，微生物生態學研究也勢必持續展現新的風貌。

微生物分離株的保存相當重要，以前有多少具研究價值的微生物曾經被分離出來，已經難以估算，但是可以確定的是，目前收集於世界各國菌株保存中心的菌株，仍不算多，加上生物多樣性條約生效，微生物株轉移變得困難。因此，有必要透過互信互惠的國際合作研究，增加微生物株的流通性。

自然界中究竟有多少能培養的微生物，近年來蔚為話題。有一說法認為，尚未培養出來的微生物，占全部微生物的 95％，甚或是 99％ 以上。存活但未能培養的微生物，也成為討論的話題。對於經核酸鹼基序列確認，但還沒分離的細菌，ICSP 允許先將其設立為相當於屬層級的候選者，然而規定一旦這類細菌被分離時，命名優先權屬於分離人，而非核酸鹼基序列發表人。如何把候選者分離，帶入實驗室研究，是今後細菌學的一個課題。至於如何把候選者和已知細菌的分類體系做有效的整合，則又是另一個課題。

細菌分類研究的起步晚於其他生物分類研究，但是經由柯恩及其後諸多微生物學者的接棒努力，細菌分類學研究進展顯著。雖然柯恩的名氣不如巴斯德與柯霍兩位同時代的微生物學者，但是他能在 130 年前，就已對細菌有相當程度的理解，並且預知了當前的發展，實在不簡單。

細菌分類研究經過一個多世紀的發展演變，看似斷斷續續，其中自始不變的是，確認細菌為生物，並且能敏銳地掌握牠們的各項特質。細菌和其他各類微生物，自有人類以來就直接或間接地影響了人類的生存。因此，人類在善加利用微生物之餘，千萬不要忘了微生物也是生物，也需要妥為保育。

資料來源： 《科學發展》2006年12月，408期，58 ~ 67頁